Zasady pomiaru metodą wygaszania fluorescencji (QF)

Wygaszanie fluorescencji — zwane również metodą QF — jest podstawowym procesem fotofizycznym, który odgrywa istotną rolę we współczesnej spektroskopii, technologiach pomiarowych i analizie molekularnej. Stało się ono niezbędnym narzędziem do pomiaru tlenu w czasie rzeczywistym, w branży przetwarzania gazu ziemnego, bioprocesach, monitorowaniu środowiska naturalnego i diagnostyce medycznej. Jego atrakcyjność wynika z precyzji, selektywności i stabilności — uzyskiwanych bez ruchomych części, materiałów eksploatacyjnych zawierających substancje chemiczne lub czułości skrośnej, które są typowymi cechami starszych konstrukcji czujników.

W tym artykule przedstawiamy podstawowe informacje na temat zasad fizyki rządzących zjawiskiem wygaszania fluorescencji, a także metod wykrywania oraz praktycznych zastosowań dla tego typu pomiarów. Zamieściliśmy tu również porównanie z innymi optycznymi lub elektrochemicznymi metodami wykorzystywanymi do pomiarów gazów.

Gdy cząsteczka pochłania energię świetlną, energia elektronów wzrasta – proces ten znany jest jako wzbudzenie. Powracając do stanu podstawowego, cząsteczka uwalnia część pochłoniętej energii w postaci światła widzialnego lub promieniowania o długości fali bardzo bliskiej światłu widzialnemu . To wtórnie emitowane światło nazywane jest fluorescencją.

Fluorescencja występuje wyłącznie w przypadku cząsteczek o określonej strukturze elektronowej – często są to barwniki organiczne lub kompleksy metali przejściowych. Emitowane światło ma zwykle dłuższą długość fali (niższą energię) niż światło pochłonięte, ze względu na utratę energii wewnętrznej podczas relaksacji. Różnica pomiędzy długościami fal absorbowanych i emitowanych jest znana jako przesunięcie Stokesa i ma kluczowe znaczenie w metodach pomiarowych opartych na zjawisku fluorescencji.

Wygaszanie fluorescencji występuje w obecności czynnika powodującego zmianę w cząsteczce substancji fluorescencyjnej emitującej światło po wzbudzeniu. "Wygaszacz" — zazwyczaj inna cząsteczka — wchodzi w interakcję ze wzbudzonym fluoroforem, umożliwiając mu bezpromienistą relaksację, czyli niewielką utratę energii (poprzez zderzenia lub oddanie energii) zamiast emitowania fotonu.

Jest kilka mechanizmów wygaszania fluorescencji, w tym:

• Wygaszanie dynamiczne (kolizyjne): podczas zderzeń cząsteczek w stanie wzbudzonym energia jest przekazywana do wygaszacza.
• Wygaszanie statyczne: przed wzbudzeniem, utworzony zostaje kompleks wygaszacz-fluorofor, który nie wykazuje zdolności fluorescencji.
• Przenoszenie energii i przenoszenie elektronów: następuje wymiana energii lub elektronów pomiędzy cząsteczkami, co zmniejsza wydajność fluorescencji.

W wielu zastosowaniach czujników przemysłowych, funkcje wygaszacza pełni tlen (O₂). Ponieważ tlen skutecznie dezaktywuje stany wzbudzone niektórych barwników, zmiany intensywności fluorescencji lub czasu jej trwania mogą być bezpośrednio związane ze stężeniem tlenu w otaczającym środowisku.

Ilościowy związek pomiędzy wygaszoną fluorescencją a stężeniem wygaszacza wyrażony jest wzorem Sterna–Volmera:

I₀ / I = 1 + K_SV[Q]

Lub równoważnie wykorzystując czas trwania fluorescencji:

τ₀ / τ = 1 + K_SV[Q]

Gdzie:

• I₀ i τ₀ to intensywność fluorescencji i czas jej trwania bez wygaszacza.
• I i τ są odpowiednimi wartościami w obecności wygaszacza.
• K_SV jest stałą Sterna-Volmera.
• [Q] to stężenie wygaszacza.

Liniowość tej zależności stanowi podstawę do wykrywania ilościowego. Monitorując zmiany intensywności fluorescencji lub czasu jej trwania, można precyzyjnie określić stężenie wygaszacza, np. tlenu rozpuszczonego lub występującego w postaci gazowej.

Optyczne czujniki tlenu działają zgodnie z zasadą która mówi, że cząsteczki tlenu mogą "wygasić" fluorescencję wzbudzonego barwnika. Taki pomiar zazwyczaj przebiega w następujący sposób:

1. Wzbudzenie: źródło światła, często niebieska dioda LED (≈470 nm), oświetla barwnik fluorescencyjny umieszczony nieruchomo w matrycy przepuszczającej tlen.
2. Emisja: w przypadku braku tlenu, barwnik emituje jasnoczerwoną lub bliską podczerwieni fluorescencję.
3. Wygaszanie: jeśli tlen jest obecny, to zderza się on z wzbudzonymi cząsteczkami barwnika i przekazuje energię bezpromieniście, zmniejszając intensywność fluorescencji i powodując zmianę długości fali.
4. Wykrywanie: wyemitowane światło powraca przez światłowód do fotodetektora, gdzie mierzone jest przesunięcie fazowe.
5. Obliczenie: system oblicza stężenie tlenu, wykorzystując stałe kalibracji uzyskane z wzoru Sterna-Volmera.

Ten cykl umożliwia pomiar tlenu w czasie rzeczywistym, bez jego zużycia i z niezwykłą czułością — od poziomu ppm (cząsteczka na milion) do stężeń procentowych.

Są dwie podstawowe metody ilościowego określania wygaszania fluorescencji: wykrywanie oparte na intensywności oraz wykrywanie czasu trwania lub przesunięcia fazowego.

• Wykrywanie oparte na intensywności: w starszych modelach optycznych czujników tlenu, spadek intensywności fluorescencji w stosunku do wartości odniesienia był wykorzystywany do określenia sugerowanego stężeniu tlenu. Jednak metoda ta jest w pewnym stopniu "wrażliwa" na zmiany źródła światła, starzenie się barwnika i ustawienie optyczne.
• Wykrywanie czasu trwania lub przesunięcia fazowego: nowoczesne czujniki wygaszania fluorescencji wykorzystują źródła światła z modulacją fazy do pomiaru opóźnienia czasowego (przesunięcia fazowego) pomiędzy światłem wzbudzającym a emitowaną fluorescencją. Ponieważ czas trwania fluorescencji zależy głównie od właściwości samej cząsteczki emitującej światło, na tę metodę znacznie mniejszy wpływ mają warunki środowiskowe lub zmiany natężenia światła.

Wraz ze wzrostem stężenia tlenu, czas trwania fluorescencji zwykle skraca się z mikrosekund do nanosekund. Metoda oparta na przesunięciu fazy charakteryzuje się szybkim czasem odpowiedzi, długoterminową stabilnością i wysoką odporność na dryft , które to cechy stanowią kluczowe zalety w zastosowaniach przemysłowych.

Wygaszanie fluorescencji to w zasadzie proces przenoszenia energii poprzez zderzenia (kolizje) pomiędzy wzbudzonymi fluoroforami i cząsteczkami wygaszacza. W przypadku wygaszania tlenem, ta interakcja regulowana jest przez kinetykę dyfuzji i nakładanie się orbitali molekularnych.

Efektywność wygaszania zależy od takich czynników jak:

• Szybkość dyfuzji tlenu przez matrycę czujnika
• Temperatura (wpływająca na dyfuzję i częstotliwość kolizji)
• Lepkość i struktura materiału podstawowego
• Czas pozostawania w stanie wzbudzonym fluoroforu

Dzięki dostosowaniu składu i porowatości folii polimerowej, osoby posiadające specjalistyczną wiedzę mogą kontrolować szybkość dyfuzji tlenu i optymalizować czas odpowiedzi czujnika oraz jego czułość.

Typowy czujnik tlenu używany do wygaszania fluorescencji składa się z trzech głównych części:

• Warstwa czujnika fluorescencyjnego (matryca barwnikowa): polimer w stanie stałym lub powłoka zol-żel z domieszką barwnika wrażliwego na tlen (takim jak kompleks rutenu lub platyny); barwnik jest wybierany ze względu na jego fotostabilność i specyficzne właściwości wygaszania
• Światłowód lub okno transmisyjne: przenosi światło wzbudzające, ze źródła do końcówki czujnika i zwraca wyemitowaną fluorescencję do detektora; zastosowanie światłowodów umożliwia nieinwazyjne, zdalne wykrywanie
• Moduł wykrywania i elektroniki: zawiera źródło światła, fotodiodę lub fotopowielacz i elektronikę przetwarzającą sygnały w celu określenia zmian fazy lub intensywności

Te podzespoły są często wbudowane w wytrzymałe konstrukcje czujników przemysłowych przeznaczonych do pomiarów w rurociągach gazów procesowych, sondach do monitorowania środowiska lub bioreaktorach, ale podstawowa zasada pomiaru pozostaje taka sama.

W porównaniu z tradycyjnymi technologiami, zastosowanie układów wykorzystujących wygaszanie fluorescencji do pomiarów przemysłowych jest korzystne ze względu na prostą konstrukcję układu optycznego i wysoką odporność na działanie substancji chemicznych. Do zalet wygaszania fluorescencji można zaliczyć między innymi:

• Selektywność ze względu na tlen: wygaszanie fluorescencji jest selektywne ze względu na o tlen, z nieznaczną czułością skrośną na parę wodną, ​​siarkowodór lub dwutlenek węgla — substancje, które często zakłócają pracę czujników elektrochemicznych.
• Stężenia na poziomie części na milion (ppm)
• Długoterminowa stabilność: układy optyczne nie zawierają żadnych materiałów eksploatacyjnych ani elektrolitów. Dzięki stabilnym matrycom barwnikowym i komponentom w stanie stałym, odstępy pomiędzy kolejnymi kalibracjami mogą być długie, a czynności konserwacyjne mają niewielki zakres.
• Szybki, nieprzerywany pomiar: ponieważ wygaszanie jest procesem, w którym kolizje cząsteczek są natychmiastowe, czujniki fluorescencji mogą zareagować na zmiany stężenia tlenu w ciągu milisekund. To umożliwia monitorowanie procesów dynamicznych w czasie rzeczywistym.
• Bezpieczeństwo i kompatybilność: ponieważ czujniki są optyczne i nie mają kontaktu z próbką ani elementami reaktywnymi, mogą bezpiecznie mierzyć zawartość tlenu w strumieniach węglowodorów, gazach palnych lub mediach biologicznych, bez ryzyka zapłonu lub skażenia.

Analizy tlenu można też wykonywać z zastosowaniem kilku innych technologii, z których każda ma swoje mocne strony, ale też i ograniczenia. Ich porównanie pozwala ustalić, w jakich przypadkach wygaszanie fluorescencji jest najkorzystniejsze.

• Zasada działania: optyczne wykrywanie wygaszania w wyniku kolizji cząstek wzbudzonego barwnika
• Typowy zakres: ppm - %
• Mocne strony: pomiar jest szybki, selektywny, bez zużywania materiałów, przy niskim dryfcie czujnika
• Ograniczenia: relatywnie wyższy początkowy koszt czujnika

• Zasada działania: pomiar ciśnienia cząstkowego tlenu za pomocą reakcji elektrochemicznej w elektrolicie stałym na bazie cyrkonu w wysokiej temperaturze
• Typowy zakres: %
• Mocne strony: wysoka dokładność w wysokich temperaturach, wytrzymałość w trudnych warunkach przemysłowych
• Ograniczenia: wymaga elementu grzejnego; wolniejsza reakcja w niskich temperaturach; zakres ograniczony do %

• Zasada działania: reakcja chemiczna pomiędzy tlenem a elektrodami w elektrolicie powoduje przepływ prądu
• Typowy zakres: ppm - %
• Mocne strony: niska cena, prosta elektronika
• Ograniczenia: wymaga regularnej wymiany ogniw; wrażliwość na H₂S i wilgoć

• Zasada działania: tlen jest przyciągany przez pole magnetyczne; mierzony jest moment magnetyczny
• Typowy zakres: %
• Mocne strony: dokładny pomiar w przypadku wysokich stężeń
• Ograniczenia: nie nadaje się do pomiaru strumieni H₂S lub węglowodorów; ograniczony do zakresu %

• Zasada działania: separacja i wykrywanie tlenu z zastosowaniem gazu (faza ruchoma) i wypełnienia lub ścianki kolumny (faza stacjonarna)
• Typowy zakres: ppm - %
• Mocne strony: wysoka precyzja analityczna
• Ograniczenia: pomiar trwa wolno (minuty na próbkę) i wymaga dużego zakresu prac obsługowych

• Zasada działania: przestrajalny laser diodowy o określonej długości fali, przy której tlen pochłania światło
• Typowy zakres: %
• Mocne strony: bezkontaktowy pomiar optyczny; może być stosowany do pomiarów in-situ lub metodą ekstrakcyjną
• Ograniczenia: zakłócenia ze strony innych gazów tła; kurz i aerozole mogą osadzać się na lustrach i oknach

W porównaniu z innymi metodami pomiaru tlenu, wygaszanie fluorescencji oferuje wyjątkowe połączenie szybkości, stabilności i odporności w środowiskach agresywnych chemicznie lub znacznie zawilgoconych.

Dyfuzja tlenu przez warstwę czujnika i czas trwania fluorescencji barwnika zależą od temperatury. Dlatego większość układów pomiarowych oferuje automatyczną kompensację wpływu temperatury, często z wykorzystaniem termistora umieszczonego w tym samym miejscu. W przypadku pomiarów fazy gazowej może być również konieczna kompensacja wpływu ciśnienia.

W trakcie wieloletniej eksploatacji, barwnik folii czujnika może stopniowo tracić kolor, a jej powierzchnia może ulec zanieczyszczeniu. Jednak w przypadku nowoczesnych materiałów, czas eksploatacji czujników przekracza zwykle trzy do pięciu lat.

Kalibracja polega zazwyczaj na poddawaniu czujnika działaniu tlenu w znanych stężeniach (np. zero w przypadku azotu lub w zakresie uznawanym dla powietrza). Ze względu na swoją stabilność, czujniki oparte na fluorescencji wymagają rzadszej kalibracji w porównaniu z alternatywnymi czujnikami elektrochemicznymi.

Nowe matryce czujników — takie jak hybrydy zol-żel, nanocząsteczki krzemionkowe i polimery fluorowane — rozszerzają zakres działania i tolerancję środowiskową czujników używanych w metodzie wygaszania fluorescencji. Te materiały zwiększają stabilność barwnika i ograniczają fotowybielanie.

Najnowsze osiągnięcia w dziedzinie sieci światłowodowych i zminiaturyzowanej fotoniki umożliwiają zastosowanie czujników wieloparametrowych, wykonujących jednocześnie pomiar tlenu, pH i temperatury w jednej sondzie.

W badaniach biologicznych i badaniu mikroprzepływów, mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM) wykorzystuje te same zasady do tworzenia map przestrzennych tlenu w skali mikroskopowej, ujawniając gradienty kluczowe dla zachowywania się komórek i procesów metabolicznych.

• Przetwarzanie gazu ziemnego - przenikanie tlenu do strumieni gazu ziemnego może powodować korozję, tworzyć mieszanki wybuchowe i pogarszać jakość produktu. Optyczne czujniki fluorescencyjne zapewniają ciągły i dokładny pomiar tlenu, od momentu gromadzenia do dystrybucji, pomagając operatorom zachować integralność systemu.
• Transformacja energetyczna – w przypadku zastosowań związanych z wychwytywaniem, wykorzystaniem i składowaniem dwutlenku węgla (CCUS), tlen jest zanieczyszczeniem, które należy usunąć. Procesy związane z biogazem/biometanem opierają się na fermentacji beztlenowej, dlatego konieczne jest zmierzenie poziomu tlenu w celu określenia, czy w fermentatorze nie ma nieszczelności. Uzyskany produkt finalny (biometan) musi również zawierać tlen w niskich stężeniach liczonych w ppm. Również produkcja wodoru z odnawialnych źródeł energii, tzw. zielonego wodoru, wiąże się z wymaganiami dotyczącymi pomiaru zawartości tlenu.
• Bioprzetwarzanie i fermentacja - w biotechnologii, kontrola rozpuszczonego tlenu ma kluczowe znaczenie dla metabolizmu komórek. Czujniki fluorescencyjne są powszechnie stosowane w fermentatorach, aby uniknąć problemów z dryftem i sterylizacją czujników elektrochemicznych.
• Monitoring środowiska i wody - metodą wygaszania fluorescencji mierzy się tlenu rozpuszczony (DO) w wodach naturalnych i ściekach. W przypadku długoterminowych pomiarów, czujniki tego typu zapewniają trwałość i niskie wymagania co do konserwacji.
• Medycyna i biotechnologia - od natleniania tkanek po systemy mikroprzepływowe, czujniki fluorescencyjne umożliwiają nieinwazyjne, optyczne mapowanie tlenu w małych objętościach, co jest niezbędne przy badaniach fizjologicznych i farmakologicznych.
• Zastosowanie w przemyśle lotniczym i energetycznym- odporne na zakłócenia elektromagnetyczne układy światłowodowe wykorzystujące wygaszanie fluorescencji są używane do przeprowadzania testów w przemyśle lotniczym oraz prób spalania i monitorowania ogniw paliwowych, w aplikacjach, w których liczy się precyzja i szybkość reakcji.

1. Berlman, I. B. Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, wyd. 2., Science Direct.
2. Demtröder, W. Laser Spectroscopy: Basic Concepts and Instrumentation, wyd. 2., Springer.
3. Endress+Hauser. TDLAS and QF analyzers technology guide.
4. Fluorescence Quenching. ScienceDirect, Elsevier.
5. Lakowicz, J. R. Quenching of Fluorescence. Principles of Fluorescence Spectroscopy, wyd. 3., 2006, Springer.
6. Lakowicz, J. R. i in. The Centenary of the Stern–Volmer Equation of Fluorescence Quenching. Journal of Photochemistry and Photobiology C: Photochemistry Reviews, tom 40, 2019, ScienceDirect.
7. Stokes Shift. IUPAC Compendium of Chemical Terminology (Gold Book), International Union of Pure and Applied Chemistry.
8. The Stokes Shift. Chemistry LibreTexts, Providence College.
9. Valeur, B. i Berberan-Santos, M. N. Molecular Fluorescence: Principles and Applications, wyd 2., Wiley-VCH.